Bibliografia – Andrologia Animal

Andrologia Animal Gratuita: Teorias e Aplicações

Peter J. Chemoweth e Steven P. Lorton

Por Anderson Mace

Muito dos materiais de estudo atualmente encontramos nas pesquisas estão contidos em artigos científicos divulgados por estudantes, professores PhDs e médicos veterinários, no entanto a boa e tradicional literatura “física de bancada” também é encontrada, através da diversidade de livrarias localizadas no Brasil e através do mercado internacional como a Amazon, por exemplo.

A ideia desta postagem não é detalhar o conteúdo de cada literatura, mas apresentar aos leitores algumas das opções que utilizei ao longo de treze anos de estudos e pesquisas para desenvolvimento do Mace Sperm Tracker® - Método para Análise Computadorizada de Espermatozoides.

 Fig. 2

Atlas de Achyut M. Phadke (Amazon)

Durante minha caminhada, através das sinuosas trajetórias dos protagonistas reprodutivos, avancei por campos humano (2007/2017) e animal (2017/2020) e não poderia deixar de relacionar aqui a literatura fantástica do Atlas de Achyut M. Phadke com o prefácio de David Mortimer (Fig.2).

Andrologia Veterinária Aplicada E Tecnologia De Sêmen Congelado

Shukla, M.  (Amazon)

Para início de apresentação do material literário especializado, iniciaremos com o compartilhamento das capas destes livros. Durante nossas postagens, sempre que recebermos novas sugestões e ou compartilhamento de informações dos leitores, através dos comentários ou novos conteúdos utilizados por nossos cientistas iremos listar e apresentar aqui no Mace Vet.

Fiquem Bem

Texto: Anderson Mace

Créditos: Anderson Mace / Anturius Brasil

Tecnologias Ópticas dos Microscópios para Análise de Sêmen

Diagrama da Tecnologia de Contraste de Fase 

em Microscópios Ópticos

Por Anderson Mace e Christian Miles

Para um bom uso do equipamento de microscopia óptica laboratorial o analista deve conhecer o tipo de engenharia utilizada na sua ferramenta de trabalho – o microscópio. Para isso, vamos fazer uma apresentação sintética de dois modelos tecnológicos utilizados. O microscópio com e sem Contraste de Fase.

Espécimes biológicos que não tenham sido corados, em geral, se apresentam transparentes, o que torna sua observação difícil ao microscópio óptico comum, já que o detalhamento da imagem fica prejudicado pela proximidade das densidades ópticas e, índices de refração das diferentes partes do tecido das células.

O microscópio de contraste de fase é um instrumento que converte diferenças do índice de refração que não podem ser vistas, em diferenças de intensidade que se tornem visíveis. As ondas de luz que atravessam os componentes celulares de densidades ópticas diferentes assim o farão em diferentes velocidades.  Desse modo, as ondas luminosas que atravessam núcleos, mitocôndrias e inclusões celulares emergirão em tempos diferentes e em fases diversas, de um elemento em relação ao outro facilitando a identificação digital das células nos “Plug-ins” de leitura.

Há também a microscopia de fase diferencial (microscopia de Nomarski), capaz de produzir imagens que se apresentam aparentemente tridimensionais durante a observação do espécime. Este tipo de microscópio também pode ser denominado microscópio de diferença “interferencial” de contraste segundo Nomarski.

As imagens abaixo servem para comparar as tecnologias, nas quais se torna notável a diferença entre a observação da mesma imagem no microscópio óptico convencional e no microscópio de contraste de fase.

Amostras superiores em Microscópios 

com Contraste de Fase, inferiores sem Contraste de Fase

 Espermatozoides de Equino com Contraste de Fase

Espermatozoides de Equino sem Contraste de Fase

Amostra em Microscópio com Contraste de Fase (Filtro Ativo Verde)

Câmara de Makler

Existem aberturas ópticas especiais na tecnologia de contraste de fase (existem kits vendidos separadamente que podem ser instalados em microscópios sem esta  tecnologia) em filtros que absorvem e mudam as fases situadas dentro do “condensador” e das lentes objetivas do microscópio de contraste de fase que convertem as diferenças de fases em intensidade diferentes.

Dispositivo de Contraste de Fase

O microscópio de fase é particularmente útil no estudo dos tecidos não corados e de células vivas (neste caso os espermatozoides). O simulador de contraste do Mace Sperm Tracker® tem como intuito tornar mais acessível à análise computadorizada de sêmen, sabendo que nem todos os profissionais possuem um microscópio com contraste de fase.

Mas, como é possível simular um contraste de fase? No Mace basta aumentar o contraste entre os espermatozoides e o plano de fundo no configurador do gravador de vídeo (MacEye®) e no configurador de Plug-in por espécie, contando também com a inversão das cores (preto e branco).

Plug-in do Mace Sperm Tracker®

O algoritmo Spermorphos do Mace Sperm Tracker® inverte a imagem do campo de observação gravado a partir do microscópio. No início do processo de análise dos vetores de motilidade o algoritmo codifica a imagem gerando um contraste de fase “simulado” tornando o método de análise mais limpo e claro para o Plug-in do Mace detectar e contabilizar precisamente os espermatozoides da amostra.

Fiquem bem

Texto: Anderson Mace e Christian Miles (Veterinário)

Imagens: Anderson Mace

Créditos: Anturius Brasil - Mace Sperm Tracker® 

Cuidados Para uma Boa Análise com o Mace Sperm Tracker®

Interface MacEye para Gravação das Amostras

Mace Sperm Tracker® - Anturius Brasil

O Mace é um programa simples e de fácil uso, porém, são necessários alguns cuidados para resultados impecáveis, tendo em mente que a chave para o sucesso é a boa gravação do vídeo, temos de nos ater a alguns detalhes:

● É recomendada uma amostra com concentração em torno de 50 x 10⁶ ml (apesar de amostras mais concentradas também serem lidas pelo software).

● Cuidado para não deixar o sêmen “escorrendo/escorregando” na lâmina, às vezes os espermatozoides mortos ficam deslizando pela lâmina, o que pode dar falsos resultados. Para tentar evitar isso, solte a lamínula com cuidado em cima da amostra.

● Grave os vídeos com boa luminosidade, contraste e foco, isso facilitará as leituras dos algoritmos do Mace Sperm Tracker, quando mais nítido e contrastado, melhor.

● Padronizar todo o processo da gravação do vídeo. A padronização é imprescindível para bons resultados, isso envolve ajustar sempre o mesmo tempo de vídeo, luminosidade, contraste, preparo de amostra, aumento do microscópio, usar o mesmo microscópio, e assim por diante.

Por que padronizar?

Em princípio por conta do "plug-in", este é ajustado para determinado microscópio, em determinado aumento, contraste, nitidez e frames. Qualquer mudança no vídeo pode interferir nos resultados, já que o plug-in foi criado para outro padrão. Outro motivo é para podermos comparar o desempenho do Mace com vídeos de mesma qualidade, e até mesmo para manter uma boa metodologia para o trabalho de rotina e estudos.

Quais outros principais fatores que podem interferir no funcionamento do Mace?

● Bloqueios por parte de alguns antivírus (é recomendado desabilitar o antivírus

durante uso do sistema).

● Utilização de outros programas em segundo plano.

● Falta de espaço de armazenamento (memória) no Disco Rígido [C].

Texto: Christian Miles e Anderson Mace

Imagens: Faculdade de Medicina Veterinária - Laboratório de Andrologia da USP

Créditos: Mace Sperm Tracker® - www.anturiusbrasil.com.br

Coeficiente de Correlação Significativa para Fertilidade

Clique na imagem para ampliá-la

Estudo das Subpopulações de Espermatozoides

Parte I

Caminhando lado a lado com os novos estudos e pesquisas sustentadas pelas colunas acadêmicas na área de andrologia animal (Faculdade de Medicina Veterinária / USP - Prof. Marcílio Nichi), o Mace foi equipado com um módulo expansivo e exclusivo que permite ao pesquisador aplicar estatísticas avançadas de Pearson e Spearman (correlação de postos) nas Subpopulações de Espermatozoides para extrair um coeficiente das variáveis aplicadas e correlacionadas.

O módulo estatístico do Mace para subpopulações de espermatozoides enumera e posiciona todos os espermatozoides contabilizados na amostra gravada e analisada, permitindo ao pesquisador ter dados precisos de todos os vetores de motilidade espermática de cada espermatozoide registrado.

     Classificando o coeficiente em três níveis de correlação temos:

         1. Negativa.

         2. Não Linear (Próximo a Zero)

         3. Positiva.

     As variáveis envolvidas nas possíveis seleções para correlação são:

     Vetores de Velocidade:

         1. VCL (Velocidade Curvilínea em mícrons / segundos)

         2. VAP (Velocidade Média em mícrons / segundos) 

         3. VSL (Velocidade Retilínea em mícrons / segundos) 

         4. STR (Retilinearidade)

     Frequência e Amplitude:

         1. BCF (Frequência do Batimento do Flagelo em Hz)

         2. ALH (Amplitude lateral da cabeça (Acrossoma) em mícrons)

Este módulo permite ao analista combinar todos os vetores dividindo-os em dois grupos (grupo de variáveis I e II) o que classificará os espermatozoides em subpopulações e seus respectivos coeficientes de correlação significativa para fertilidade.

Por exemplo:  Fazemos uma correlação entre VCL e BCF, temos de forma simplificados três possibilidades, uma correlação positiva, próximo a 1, onde há uma correlação linear positiva no aumento dos dois valores. Quando o coeficiente apresenta uma correlação negativa, próximo a -1, indica que os dois valores possuem uma correlação inversa, a medida em que um aumenta o outro diminui. Se a correlação for fraca ou não linear, próximo a 0, significa que eles não conversam entre si.

Fiquem bem

Continua ...

Texto e Pesquisa: Christian Miles e Anderson Mace

Desenvolvimento e imagens: Anderson Mace

Créditos: Mace Sperm Tracker® – Anturius Brasil 

Hiperativação Espermática

Hiperativação Espermática, o que é?

A Hiperativação é um processo importante para a fecundação e fertilização, este processo acontece durante a passagem do espermatozoide pelo oviduto da fêmea, se caracteriza por um movimento vigoroso, não linear e não progressivo, sua amplitude do batimento flagelar é aumentada, tem aumento médio do movimento lateral da cabeça e cauda, associados com motilidade lenta ou não progressiva com baixa frequência flagelar.

A hiperativação é um efeito complexo, dependente de diversos acontecimentos, desde as alterações na membrana plasmática causada pelo colesterol que aumenta a permeabilidade aos íons de cálcio de bicarbonato, hiperpolarização da membrana, mudanças na fosforilação de proteínas, atividade de proteínas quinases, dentre outros eventos que necessitam de um texto apenas para eles.

Trajetória de um espermatozoide hiperativo

(vídeo gravado em baixa velocidade para observação do deslocamento)

A hiperativação espermática concede ao espermatozoide a capacidade de penetrar o cumulus oophorus e a zona pelúcida, fatores essenciais para a fecundação. Em suma, esse é um processo biológico que acontece com o espermatozoide dentro do oviduto, que altera suas características trajetórias e lhe concede a possibilidade da fecundação.

Trajetória de um espermatozoide controlado

(vídeo gravado em baixa velocidade para observação do deslocamento)

Texto: Christian Miles - Veterinário

Imagens/vídeos: Anderson Mace / Mace Sperm Tracker®

A Visão Sistêmica da Análise de Espermatozoides Assistida por Computador – CASA

Por Anderson Mace e Christian Miles

O que é CASA?

Análise de Espermatozoides Assistida por Computador

Em sua essência, CASA é um sistema automatizado, para formar, digitalizar e avaliar imagens sucessivas de uma amostra de sêmen, a fim de mensurar com precisão cada célula espermática, sendo possível mensurar a qualidade do sêmen com base nos parâmetros avaliados (Amann e Katz, 2004).

Agora perguntamos, visualizar, contar, ver a morfologia de espermatozoides de forma subjetiva sob a óptica microscópica, estaria a frente da metodologia digital de análise realizada sob a crítica algorítmica objetiva, sob a lógica e estatística de uma inteligência artificial?

Já é um consenso na literatura que a análise subjetiva possui uma margem grande de erros, ou seja, sistemas automatizados são mais precisos, contudo também possuem limitações, como custo, logística de trabalho, controle de qualidade, manutenção, entre outros itens.

O Mace Sperm Tracker é resultado da colaboração mútua de pesquisas acadêmicas, ideias e inovação, para fazer com que este recurso seja acessível, agregando novas fórmulas, novos algoritmos e novas interpretações do protagonista maior – O Espermatozoide.

A ideia nunca foi fazer um CASA, mas algo diferente, pois, mesmo entre os sistemas casa existe desigualdade. Não é sensato supor que os resultados de uma mesma amostra analisada por dois sistemas CASA diferentes sejam idênticos, pois, a amostra seria analisada por hardware e algoritmos diferentes (Amann e Waberski, 2014).

Romper as barreira da análise de sêmen com o objetivo de dar acesso a um recurso que poucos possuem, onde atualizações e sugestões inovadoras foram agregadas e desenvolvidas de acordo com as necessidades dos médico veterinários – O Mace é um compartilhador de ideias, de criações e transferência de estudos.

Fiquem bem

Amann R, Katz DF. Reflections on CASA after 25 years. J Androl, v.25, p.317-325, 2004.

Amann R, Waberski D. Computer-assisted sperm analysis (CASA): Capabilities and potential developments. Theriogenoly. v.81, p.5-17, 2014

O Som dos Espermatozoides

Créditos: Mace Sperm Tracker® - Anderson Mace
Colaboração: Anturius Brasil - www.anturiusbrasil.com.br